阿尔茨海默病转基因小鼠模型啊阿尔茨海默症

前言

阿尔茨海默病（AD）是一种神经退行性疾病，是导致痴呆症的最常见原因。目前，全球有超过5500万人患有痴呆症，预计到2030年痴呆症患病人数将达到7800万人。在我国近2.5亿60岁及以上成年人中，痴呆症和轻度认知障碍（MCI）的患病率分别为6.04%和15.54%。其中，AD患者占比近3.9%，共计约983万人。

AD 在神经病理学上表现为两种类型的沉积物，即淀粉样蛋白-β 斑块和神经原纤维缠结。淀粉样蛋白-β 斑块沉积在细胞外，主要由淀粉样蛋白-β (Aβ) 组成。Aβ 是由其前体淀粉样蛋白前体 (APP) 在 β 和 γ 分泌酶的作用下依次裂解而产生的。神经原纤维缠结是神经元内聚集物，由微管结合蛋白 tau 的过度磷酸化形式组成。对 AD 患者生物标志物变化的纵向研究表明，首先发生 Aβ 沉积，然后是 tau 病理的积累。然而，这些病理并不是孤立的，而是形成一个连续体，Aβ 和 tau 的沉积在空间和时间上与 AD 的进展有关。

AD相关动物模型对于疾病机制研究和相关药物研发十分重要，动物模型需最大程度复制人类AD脑内的重要病理生理表现，即Aβ聚集形成的蛋白斑块和Tau蛋白异常磷酸化形成的细胞内神经原纤维缠结（NFT）。这两种典型的病理表现以及神经元丢失、记忆障碍、认知功能进行性下降是AD重要的临床病理表现。虽然目前尚无能够完全复制人类AD病理表现的动物模型，但转基因动物模型在活体实验、针对特定基因、进行性病理发展以及药物应用等方面均具有显著优势，了解特定动物模型的特点和局限性，对今后开展有针对性的研究十分重要。

基因突变与家族性阿尔茨海默病有关

第一个被确定为常染色体显性 AD 病因的突变发生在 APP 基因中，随后在 PSEN1 和 PSEN2 中也发现了突变。除了点突变外，APP 基因拷贝数的增加也会导致 AD。在 MAPT 基因中未发现遗传性 AD 突变，但 MAPT 突变会导致家族性额颞叶痴呆 (FTD) 和其他几种 tau 蛋白病。最常见的 FTD 突变是 P301L 和 P301S，它们会导致 tau 聚集。基于这些突变，已经开发出具有聚集性 tau 病理的小鼠模型。

APP 中的 FAD 突变根据受影响家族的起源区域命名，主要发生在其两个裂解位点，导致 Aβ 产生过量或聚集增加。瑞典突变 (K670N/M671L) 位于 β-分泌酶裂解位点，导致 β-分泌酶介导的裂解增加，从而导致 Aβ40 和 Aβ42 的产生增加。印第安纳突变 (V717F)、伦敦突变 (V717I) 和 γ-裂解位点的其他突变促进 Aβ42 的产生，其毒性比 Aβ40 更大。Aβ 内的 APP 突变，例如“北极突变”(E693G) 和“道奇突变”(E693Q) 突变，增加 Aβ 聚集并促进稳定的寡聚体和原纤维的形成。 此外，FAD 中的几乎所有 PSEN1 和 PSEN2 突变都会导致 Aβ42/Aβ40 比率增加。此外，还发现了一种针对 AD 和与年龄相关的认知衰退的保护性 APP 变体 (A673T)。值得注意的是，这种变体降低了 β-分泌酶的裂解和总 Aβ 生成，支持了脑 Aβ 沉积是 AD 发病机制的核心机制这一观点。

基于 APP 突变的 Aß 沉积小鼠模型

野生型小鼠即使到了老年也不会出现老年斑或神经原纤维缠结，因此不能作为 AD 模型动物。但是，几乎所有 FAD 相关突变都与 Aβ 生成/聚集的改变有关，而基因工程技术的进步使得利用 APP 和 PSEN1 基因开发模型小鼠成为可能。

PDAPP 小鼠

PDAPP 是第一个被发现具有 Aβ 沉积并表达由 PDGF-β 启动子驱动的印第安纳突变 (V717F) 的 AD 小鼠模型。PDAPP 小鼠在约 6-9 个月大时开始在大脑皮层中形成人类 Aβ 沉积，并伴有与年龄相关的神经胶质增生增加。在 8 个月大时，海马齿状回分子层中的突触和树突密度降低。到 3 个月大时，PDAPP 小鼠表现出记忆缺陷，并且也与年龄相关。

Tg2576小鼠

Tg2576 是最广泛使用的 AD 小鼠模型之一，该模型过度表达由仓鼠朊病毒启动子驱动的瑞典突变（K670N/M671L）的人类 APP 基因。Tg2576 小鼠在 11 至 13 个月大时出现淀粉样斑块形成，在 10 至 16 个月大时，新皮质和海马所有区域的斑块内或周围出现小胶质细胞活化。虽然没有检测到神经元丢失，但发现 10 个月大时一些记忆功能（如空间交替和空间参考学习）受损。

APP23小鼠

APP23 小鼠表达人类 APP 基因，该基因带有瑞典突变 (K670N/M671L)，由人类 Thy1 启动子驱动。APP23 小鼠从 6 个月大开始在脑中形成 Aβ 沉积物，这些沉积物的大小和数量随着年龄的增长而增加，导致 24 个月大时占据大脑皮层和海马的大面积区域。在有 Aβ 斑块的脑区可以检测到广泛的神经胶质反应。在 12 个月大的小鼠中，Aβ 沉积物附近的神经元损失非常明显。该模型的认知能力下降始于 3 个月大，在淀粉样蛋白沉积之前。

J20小鼠

J20 小鼠在 PDGF-β 启动子下过度表达人类 APP 基因，该基因具有两个 FAD 相关突变，即瑞典突变 (K670N/M671L) 和印第安纳突变 (V717F)。J20 小鼠在 5-7 个月大时出现弥漫性淀粉样蛋白沉积，在 8-10 个月大时出现高海马斑块负担。在 6-9 个月大时，海马中观察到活化星形胶质细胞和小胶质细胞数量增加。在淀粉样蛋白沉积之前，该模型中会出现神经元丢失和一些认知缺陷。

TgCRND8小鼠

TgCRND8 小鼠在仓鼠朊病毒启动子下过度表达携带两个 FAD 相关突变（瑞典突变 (K670N/M671L) 和印第安纳突变 (V717F)）的人类 APP 基因。在此小鼠模型中，Aβ 沉积始于 3 个月大，并随着年龄的增长而变得更加广泛。活化的小胶质细胞在 3 个月大时积累淀粉样斑块，随后不久出现强烈的星形胶质细胞反应。3 个月大时，空间信息获取和学习逆转受损。

PS2APP 鼠标

PS2APP小鼠是由APPswe小鼠和PS2(N141I)小鼠两个单转基因模型杂交产生的，该模型在Thy1.2启动子和小鼠朊病毒启动子下分别过表达携带瑞典突变(K670N/M671L)的人类APP基因和携带N141I突变的人类PSEN2基因。9月龄小鼠的下托和前外侧皮质开始出现淀粉样斑块，在13～17月龄时不仅扩散到大部分新皮质、海马结构和杏仁核，还扩散到丘脑和脑桥核。9月龄小鼠在Aβ斑块周围观察到胶质瘤。8月龄小鼠的认知功能受损。

APPswe/PSN1dE9 (APP/PS1) 小鼠

APPswe/PSEN1dE9 小鼠是通过共注射由小鼠朊病毒启动子驱动的两个载体而开发的。一个载体编码携带瑞典突变 (K670N/M671L) 的 APP 基因，另一个载体编码外显子 9 被删除的 PSEN1 基因 (dE9)。APPswe/PSN1DE9 小鼠从 6 月龄开始出现 Aβ 沉积，到 9 月龄时在海马和皮质中变得丰富。这些沉积物被反应性星形胶质细胞包围。12 月龄时，莫里斯水迷宫表现受损。

Tg ArcSwe 小鼠

Tg-ArcSwe 小鼠过表达人类 APP 基因，该基因携带两个 FAD 相关突变，即北极突变 (E693G) 和瑞典突变 (K670N/M671L)，由 Thy1 启动子驱动。在 5-6 个月大时观察到细胞外淀粉样蛋白沉积，并在 9 个月大时在大脑皮层、下托和海马中变得非常常见。淀粉样斑块周围有明显的星形胶质增生。4 个月大的小鼠空间学习能力受损。在该小鼠模型中未检测到神经元丢失。

5xFAD 小鼠

该小鼠模型是通过在APP/PS1双转基因小鼠中共表达以下五种FAD突变而产生的：APP基因的瑞典（K670N/M671L）、佛罗里达（I716V）、伦敦（V717I）突变，以及PSEN1基因的M146L和L286V突变，导致Aβ斑块形成加速，脑内Aβ42水平非常高。脑内Aβ斑块在2月龄时出现，并随年龄增长而增加，在6-​​9月龄时趋于饱和，并伴有严重的神经胶质增生。6月龄时认知功能受损。

A7小鼠

A7 小鼠过度表达 APP，携带由 Thy1.2 启动子驱动的瑞典 (K670N/M671L) 和奥地利 (T714I) 突变。A7 小鼠在 9 至 12 个月大时大脑皮层出现进行性淀粉样蛋白沉积。到目前为止，除 Aβ 沉积外，尚未报告其他病理。

AppNL-GF 基因敲入小鼠

小鼠中 AppNL-GF 基因敲入可增加 Aβ42 的数量，而不会过度表达人类 APP 基因。Aβ 序列是人源化的，瑞典 (K670N/M671L)、北极 (E693G) 和伊比利亚 (I716F) 突变被引入 App 小鼠基因。皮质 Aβ 沉积从 2 个月开始，到 7 个月大时几乎饱和，并伴有严重的神经胶质增生。6 个月大时，空间交替任务的表现、学习能力和空间记忆保持能力受损。小鼠中的 AppNL-GF 基因敲除未显示任何神经元丢失。

基于 Tau 突变的小鼠模型

微管相关蛋白Tau（MAPT）属于MAPs蛋白家族，虽然目前尚未发现FAD患者存在MAPT基因的家族性突变，但家族性FTD相关突变的发现推动了tau病小鼠模型的研发。tau病理小鼠模型大致分为两种，即转基因模型和tau种子注射模型。

Jnpl3 小鼠

JNPL3 小鼠是首个已建立的携带 MAPT 突变的小鼠模型。它们表达携带由小鼠朊病毒蛋白启动子驱动的 P301L 突变的人类 0N4R-tau。该模型的特征是强烈的运动和行为缺陷，这可能是由脊髓的神经病理学变化引起的。在 4.5 个月大时，它们在间脑、脑干、小脑核和脊髓中表现出缠结的病理，以及运动障碍。神经元丢失发生在 10 个月大时，尤其是在脊髓中。在 10 个月大时，脑干、间脑和端脑底部的星形胶质细胞增生可见。

PS19小鼠

PS19 小鼠表达人类 1N4R-tau，其中 P301S 突变由小鼠朊病毒启动子驱动。PS19 小鼠的特征是早期突触丢失和小胶质细胞激活，然后出现神经原纤维缠结病理和神经元丢失。PS19 小鼠早在 3 个月大时就会出现神经胶质增生。神经原纤维缠结状内含物从 6 个月大开始出现，并广泛分布于新皮质、杏仁核、海马、脑干和脊髓。神经元丢失和脑萎缩出现在 8 个月大之后，主要发生在海马中，但也会扩散到新皮质和内嗅皮质。与 3 个月大相比，6 个月大的小鼠星形胶质增生显著增加。抬起尾巴时会出现运动障碍，例如咬紧牙关和肢体回缩，随后出现肢体无力。 这些缺陷会在 7-10 个月大时发展为瘫痪，大约 80% 的 PS19 小鼠会在 12 个月大时死亡。

rTg4510 小鼠

rTg4510 小鼠表达具有 P301L 突变的人类 0N4R-tau，其独特之处在于可以调节转基因表达。四环素控制的反式激活因子在钙/钙调蛋白依赖性蛋白激酶 IIα (CaMKIIα) 启动子的控制下表达。通过施用四环素类似物强力霉素可灭活转基因表达。这种突变人类 tau 的表达水平比内源性小鼠蛋白高 13 倍。然而，转基因会破坏六个内源性小鼠基因，包括成纤维细胞生长因子，这可能会影响在 rTg4510 小鼠中观察到的神经病理学和神经退行性表型。5.5 个月后，在皮质和海马中观察到嗜银缠结状内含物。 海马 CA1 区神经元从 5.5 个月大开始丢失，10 个月大时出现严重的前脑萎缩。2.5 至 4 个月大时，空间记忆力受损。值得注意的是，用阿霉素抑制转基因后，神经元死亡停止，认知功能下降停止甚至逆转。

3xTg 小鼠

该模型通过将两个携带 FAD 相关突变的 AD 相关人类基因（APP 的瑞典突变 (K670N/M671L) 和 MAPT 的 P301L 突变）共同注射到 Psen1M146V 敲入纯合小鼠胚胎中建立。两种转基因的表达均受小鼠 Thy1.2 启动子调控。小鼠表现出进行性神经病理学，包括细胞内和细胞外 Aβ 沉积以及构象改变的磷酸化 tau 聚集体。

人类 MAPT 基因敲入小鼠

这些小鼠携带人源化的 WT MAPT 基因，而不是内源性小鼠 MAPT 基因。它们表达人类 tau 的所有六种亚型，其中 4R mRNA 的水平约为 3R mRNA 的 70%。AppNL-GF/MAPT 双敲除小鼠缺乏神经原纤维缠结，不会表现出神经退化，但它们会出现淀粉样斑块和 Aβ 相关病理。值得注意的是，无论是否存在 Aβ 沉积，tau 人源化都会加速 AD 小鼠脑源性 tau 的细胞间传播。

种子注射模型

第一个种子注射模型于 2009 年建立，展示了 tau 的传播和扩散。种子注射模型是通过将 AD 患者或模型小鼠的脑裂解物或重组 tau 注射到小鼠脑中创建的。在这些模型中，病理性 tau 的扩散通过突触连接发生。种子注射模型已经确定了影响 tau 病理的几个重要因素，包括年龄、Aβ、tau 的寡聚化和剪接异构体。

AD小鼠模型的应用

任何药物在进行临床研究之前，都必须通过动物模型的临床前研究来证实其安全性和有效性，上述各类AD小鼠模型，在AD药物的临床前研究中已被广泛应用。

Semagacestat 是首个进入 III 期临床试验的 γ-分泌酶抑制剂，在研发过程中，曾使用 PDAPP 小鼠进行药效学研究。然而，semagacestat 在 PDAPP 小鼠中引发了认知能力下降、皮肤癌和感染等不可逆症状，导致 III 期试验中止。此外，Tg2576 小鼠曾用于开发和比较其他 γ-分泌酶抑制剂，如阿伐他汀。然而，这些小鼠出现了胃肠道和皮肤不良事件，阿伐他汀在 II 期临床试验中被终止。

自 20 世纪 90 年代以来，人们就开始研究使用抗 Aβ 抗体来预防 Aβ 斑块的形成。目前，lecanemab、gantenerumab、donanemab 和 aducanumab 已获批准或处于开发的最后阶段。所有这些药物都已在小鼠模型中进行了临床前研究。Lecanemab 是一种抗原纤维抗体，是小鼠抗体 mAb158 的人源化版本。给老年 Tg-ArcSwe 小鼠施用 mAb158 可减少 Aβ 纤维，而不会改变不溶性 Aβ 水平。Gantenerumab 可识别 Aβ 的 N 端和中心区域，并可防止 PS2APP 小鼠形成新的斑块。Donanemab 是一种针对焦谷氨酸形式的 Aβ 的抗体，可清除老年 PDAPP 小鼠中现有的斑块。Aducanumab 与聚集形式的 Aβ 结合，但不与 Aβ 单体结合。 Aducanumab 与脑 Aβ 沉积物结合，并以剂量​​依赖性方式减少老年 Tg2576 和 APP23 小鼠模型中的 Aβ 负担。这些发现表明，基于 APP 突变的 Aβ 沉积小鼠模型可能有助于开发抗 Aβ 沉积疗法。

概括

Aβ和tau是AD的两个主要致病因素。基因工程小鼠的使用在AD治疗策略和诊断生物标志物的开发中发挥了重要作用。然而，能够复制在散发性AD患者中观察到的Aβ和tau沉积模式的AD小鼠模型尚未建立。然而，猫、狗和非人灵长类动物会自发出现年龄依赖性的AD样脑病理，因此使用非人灵长类动物对于评估AD治疗的有效性和安全性尤为重要。最后，进一步了解Aβ和tau沉积的病理过程及其在动物中的传播将有助于开发更准确的疾病模型，从而缩小临床前研究和临床试验之间的差距。

参考：

1. 阿尔茨海默病的小鼠模型。Front Mol Neurosci。2022；15：912995。

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